細(xì)胞傳代培養(yǎng)是細(xì)胞培養(yǎng)過程中的一項(xiàng)重要操作，用于擴(kuò)大細(xì)胞數(shù)量并避免細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)期或衰亡期。傳代培養(yǎng)的基本步驟包括準(zhǔn)備細(xì)胞、清洗細(xì)胞、消化細(xì)胞和分瓶培養(yǎng)。以下是詳細(xì)的步驟和注意事項(xiàng)：
準(zhǔn)備細(xì)胞
觀察狀態(tài)：在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，無微生物污染。
時(shí)機(jī)選擇：細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代，避免細(xì)胞過度生長(zhǎng)導(dǎo)致的生長(zhǎng)抑制或老化。
清洗細(xì)胞
清洗殘留：用PBS清洗細(xì)胞，去除舊培養(yǎng)基和血清，避免血清中的成分干擾胰蛋白酶消化。
消化細(xì)胞
胰酶加入：使用0.25%胰蛋白酶，量約為培養(yǎng)瓶面積的覆蓋量（如100mm培養(yǎng)皿加1ml，6孔板加200ul）。
消化過程：室溫靜置15-30秒后，輕輕吸走大部分胰酶，保留幾滴繼續(xù)消化，觀察細(xì)胞變圓情況，通常消化10-15分鐘。
終止消化：加入完全培養(yǎng)基終止消化，并輕輕吹打分散細(xì)胞。
分瓶培養(yǎng)
細(xì)胞計(jì)數(shù)：根據(jù)需要調(diào)整細(xì)胞濃度，常用的方法是一分為二或一分為多，但應(yīng)保持每次傳代的細(xì)胞濃度一致。
濃度調(diào)整：使用快速換算公式，確保細(xì)胞密度適宜，例如1:3或1:4的傳代比例。
分裝：將細(xì)胞懸液均勻分裝到新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)基。
標(biāo)記：做好傳代時(shí)間和細(xì)胞信息的標(biāo)記。
特別注意
EDTA的使用：對(duì)于細(xì)胞間連接緊密的消化，可加入EDTA輔助消化，預(yù)冷的含EDTA胰蛋白酶有助于控制消化時(shí)間。
無菌操作：全程嚴(yán)格無菌操作，避免污染。
細(xì)胞密度：保持適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度，避免過高或過低影響細(xì)胞生長(zhǎng)。
消化時(shí)間：根據(jù)細(xì)胞類型和消化情況靈活調(diào)整，防止消化過度或不足。
傳代頻率
對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：在細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期但未達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行傳代。
生長(zhǎng)模式：定期傳代確保細(xì)胞的生物學(xué)行為穩(wěn)定，便于監(jiān)測(cè)健康狀態(tài)。
常見問題
黑點(diǎn)處理：如果出現(xiàn)黑點(diǎn)，首先判斷是否為污染，非污染情況下可通過更換培養(yǎng)瓶、清洗細(xì)胞、調(diào)整消化時(shí)間和血清濃度來處理。
細(xì)胞密度：保持合適的接種密度，過低會(huì)影響細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)和生長(zhǎng)因子濃度，過高可能導(dǎo)致老化和堆疊。
通過以上步驟和注意事項(xiàng)，可以有效地進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，維持細(xì)胞的健康狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)的可靠性。
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