免疫熒光（IF）是一種用于檢測以及識別細(xì)胞和組織中蛋白質(zhì)和其他分子的亞細(xì)胞分布和遷移的強(qiáng)大檢測技術(shù)。IF可用作免疫組織化學(xué) (IHC) 或免疫細(xì)胞化學(xué) (ICC) 中使用的傳統(tǒng)顯色標(biāo)記的替代物。通過使用多種標(biāo)記物的二級抗體，可以研究感興趣蛋白的共定位，這是不能通過常規(guī)IHC或ICC實現(xiàn)。這是同時分析許多目標(biāo)蛋白時的一個優(yōu)勢，可同時生成大量亞細(xì)胞定位的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。免疫熒光染色是一種常用的細(xì)胞和組織學(xué)研究技術(shù)，它利用特異性抗體與標(biāo)記熒光染料結(jié)合，來檢測和定位細(xì)胞中的特定蛋白質(zhì)或其他分子。
以下是免疫熒光染色的原理和步驟：
原理： 免疫熒光染色的原理是利用特異性抗體與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合，再使用熒光標(biāo)記的二抗與原抗體結(jié)合，從而標(biāo)記目標(biāo)蛋白質(zhì)。熒光信號可以通過熒光顯微鏡觀察，以顯示目標(biāo)蛋白質(zhì)的位置和分布。免疫熒光染色可以用于檢測和定位細(xì)胞中的特定蛋白質(zhì)、抗原、細(xì)胞器等，對于研究細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)、功能和病理生理過程具有重要意義。
細(xì)胞免疫熒光染色適用于鑒定細(xì)胞的免疫熒光檢測的實驗方法。
步驟：
1、細(xì)胞或組織樣品的固定：通常使用甲醛或乙醛來固定細(xì)胞或組織，以保持其形態(tài)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性。
2、抗體的孵育：將特異性抗體加入到樣品中，與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合。
3、洗滌：用緩沖液洗去未結(jié)合的抗體。
4、二抗的孵育：加入熒光標(biāo)記的二抗，與原抗體結(jié)合。
5、洗滌：用緩沖液洗去未結(jié)合的二抗。
6、熒光顯微鏡觀察：使用熒光顯微鏡觀察樣品，熒光信號可顯示目標(biāo)蛋白質(zhì)的位置和分布。
實驗過程 (48孔板為例)：
1、細(xì)胞種植：將細(xì)胞消化后按照所需濃度種植于48孔板，置于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。
2、固定：取出48孔板，棄去培養(yǎng)基，每孔加入PBS 500μl，靜置5min，吸走液體，每孔加入200μl 的4%多聚甲醛固定液，室溫固定30min。
3、洗滌：每孔加入PBS 500μl，靜置5min，吸走液體，重復(fù)3次。
4、通透：每孔加入200μl 的0.1% Triton x-100，室溫靜置15min。（膜表達(dá)的蛋白鑒定建議不通透，具體參考抗體說明書）
5、洗滌：每孔加入PBS 500μl，靜置5min，吸走液體，重復(fù)3次。
6、封閉：每孔加入500μl 5%牛血清封閉液，37℃孵育2h或者置于冷藏冰箱中過夜，棄去液體。
5.7一抗：每孔加入200μl采用2%牛血清稀釋的抗體（稀釋比例參考抗體說明書），37°C靜置2h或者4℃過夜。
8、洗滌：PBST每孔500μl，靜置5min，吸走板中液體，重復(fù)3次。
9、封閉：每孔加入200μl 5%牛血清封閉液，室溫封閉15min。（本底高的可以加這一步）
10、二抗：每孔加入200μl采用2%牛血清稀釋的二抗（種屬和一抗的要對應(yīng)，舉例：一抗是來源是兔抗X，二抗就用Y 抗兔-熒光，稀釋比例參考抗體說明書），37℃避光孵育1h。
11、洗滌：PBST每孔500μl，靜置5min，吸走板中液體，重復(fù)3次。
12、染核：Hoechst 濃度2μg/ml，每孔200 μl，室溫避光染色15min。
13、洗滌：PBST每孔500μl，靜置5min，吸走板中液體，重復(fù)3次。
14、拍照：洗滌完畢每孔加入200μl PBS,將細(xì)胞置于顯微鏡下觀察，選擇所需倍數(shù)，拍照保存。
