聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物是指通過特定的引物和酶在模板DNA上進(jìn)行擴(kuò)增的DNA片段。這種產(chǎn)物是特定的DNA序列的拷貝,通常由一對(duì)引物指導(dǎo)DNA聚合酶沿模板DNA合成。具有廣泛的生物學(xué)應(yīng)用價(jià)值,且其純化和分析需要考慮多種因素以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。
目前主流的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)方法分為染料法和探針法,染料法以SYBRGreen法為代表,SYBRGreen染料游離時(shí)熒光微弱,但但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后,熒光大大增強(qiáng),反應(yīng)管中的熒光強(qiáng)度與反應(yīng)管中雙鏈DNA的數(shù)量成正比例關(guān)系,因此熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)步驟可以通過檢測(cè)熒光計(jì)算反應(yīng)管中產(chǎn)生的雙鏈DNA(PCR產(chǎn)物)的量,但該方法沒有特異性,非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)物也會(huì)被計(jì)入。
閾值循環(huán)數(shù) Threshold cycle (Ct) 也寫作Cq值,熒光信號(hào)大于熒光閾值時(shí)PCR循環(huán)數(shù)。儀器軟件通常將第3-15個(gè)循環(huán)的熒光值設(shè)為基線(baseline),是由于測(cè)量的偶然誤差引起的。閾值(threshold)一般是基線的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。在實(shí)際操作中也可以手動(dòng)調(diào)節(jié)。高于閾值的熒光信號(hào)被認(rèn)為是真實(shí)的信號(hào),用于定義Ct值。Ct會(huì)受到閾值的影響,每次試驗(yàn)由于樣品和儀器的不同會(huì)導(dǎo)致基線不同,進(jìn)而影響閾值和Ct值。
血清是血液凝固析出的淡黃色透明液體,是血漿去除纖維蛋白后的混合物,主要成分包括蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、維生素和多肽(如生長(zhǎng)因子、胰島 素、促生長(zhǎng)激素)等。血清是細(xì)胞培養(yǎng)過程中重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),同時(shí)也對(duì)細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用。
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