PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)的簡稱。是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。通過DNA基因追蹤系統(tǒng)，能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量，其精確度高達(dá)納米級別。PCR驗(yàn)室又叫基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室。
PCR技術(shù)原理：
DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。
在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。（ DNA高溫變性低溫復(fù)性）發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。
下面一起了解提高PCR反應(yīng)結(jié)果成功的參考技巧：
1、將PCR反應(yīng)的試管與反應(yīng)板緊貼。
2、當(dāng)酶反應(yīng)混合物以70℃“熱啟動"開始循環(huán)時，切記在加入酶后稍微振蕩一下，因?yàn)樵?.2-ml的PCR管中不能均勻傳熱。
3、不要隨意減少dNTP的用量，它是一個系統(tǒng)的因素，必須與其它成份保持平衡。
4、對于有問題的PCR反應(yīng)，例如模板的量少，模板不純和環(huán)狀模板等，先嘗試加Taq酶前的體系進(jìn)行預(yù)變性，后加模板進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。
5、沒有擴(kuò)增產(chǎn)物：在提供MgCl2緩沖液中，以0.25mmol/L為梯度增加MgCl2濃度；無MgCl2的緩沖液以0.5 mmol/L為梯度增加MgCl2濃度。
6、泳道中出現(xiàn)模糊條帶，如果DNA模板中存在RNA，則按上述提示濃度補(bǔ)加MgCl2，因?yàn)樵赑CR反應(yīng)中可能缺少游離的Mg2+。
7、檢查退火溫度和變性條件，如果有需要的話，可降低退火溫度。
8、檢查模板和引物的用量。
9、增加循環(huán)次數(shù)和/或模板DNA的用量。
10、泳道中出現(xiàn)模糊條帶： 減少循環(huán)次數(shù)或模板DNA的用量。提高退火溫度，但不要超過68℃。 重新設(shè)計(jì)引物或設(shè)計(jì)更長的引物。
11、 建議使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃時不能有效地使模板變性。最佳反應(yīng)體積為50ml，推薦用30ml礦物油覆蓋（對蓋子加熱的PCR儀可以不加）。大多數(shù)反應(yīng)中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多數(shù)情況下可以得到滿意的結(jié)果。建議使用1.75mmol/L MgCl2∶350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2∶500mmol/L dNTP組合的混合物。然而要得到最佳結(jié)果，優(yōu)化Mg2+的濃度是必需的。
12、基因組DNA模板的質(zhì)量顯著影響PCR反應(yīng)。因此推薦使用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA的長度。DNA片段長度可以超過50kb，傳統(tǒng)的基因組DNA能擴(kuò)增片段至10kb。要擴(kuò)增更長的片段應(yīng)使用超純或高分子量的DNA。請查閱高分子量DNA提取操作過程相關(guān)文獻(xiàn)。降低二級結(jié)構(gòu)和引物二聚物形成的可能性。進(jìn)行長片段PCR擴(kuò)增時，引物長度一般為24~34個核苷酸，溶點(diǎn)在60~68℃間。使用這類引物可提高PCR反應(yīng)的退火溫度來增加反應(yīng)的特異性。這點(diǎn)非常重要，長片段擴(kuò)增的效果往往受到非特異性短片段優(yōu)先擴(kuò)增的影響。
13、變性：第一步變性在94℃下進(jìn)行2分鐘。在循環(huán)過程中盡可能縮短變性時間（94℃下進(jìn)行20--30秒），除非模板中富含GC，則95℃下變性30秒。這可以防止DNA脫嘌啉和鏈斷裂，對于所需擴(kuò)增的基因組DNA片段終長度超過12 kb時，應(yīng)該盡可能的降低變性溫度。
14、延伸：68--72℃下進(jìn)行延伸操作。循環(huán)延伸：盡量采用循環(huán)延伸的條件，若PCR儀無此功能，則必須增加延伸的時間，例如在擴(kuò)增10kb片斷時，延伸時間用10分鐘替代原來的8分鐘。長片斷PCR系統(tǒng)擴(kuò)增的片斷其3’-末端帶有一個突出的A，因此建議采用T/A克隆。若要進(jìn)行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶將PCR產(chǎn)物補(bǔ)平后再進(jìn)行。測序時因酶的混合物帶有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法進(jìn)行測序不能產(chǎn)生均一的（染色體）帶型。
15、引物設(shè)計(jì)： 一般長度20-30bp； 至少50%的GC含量；避免引物二聚體和二級結(jié)構(gòu)； 引物對的Tm值應(yīng)該接近。
注意事項(xiàng)：
1、加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。
2、使用干凈的塑料容器配置洗滌液。
3、按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。
4、底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。
5、洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。
6、使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器 。
7、實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
8、試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。
9、不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
ELISA定性測定的結(jié)果判斷是對受檢標(biāo)本中是否含有待測抗原或抗體作出 "有"或"無"的簡單回答，分別用"陽性"、"陰性"表示。"陽性"表示該標(biāo)本在該測定系統(tǒng)中有反應(yīng)。"陰性"則為無反應(yīng)。用定性判斷法也可得到半定量結(jié)果，即用滴度來表示反應(yīng)的強(qiáng)度，其實(shí)質(zhì)仍是一個定性試驗(yàn)。在這種半定量測定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，呈陽性反應(yīng)的稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽性、弱陽性具定量意義。在間接法和夾心法 ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。兩類反應(yīng)的結(jié)果判斷方法不同，分述如下。
1、 間接法和夾心法
這類反應(yīng)的定性結(jié)果可以用肉眼判斷。目視標(biāo)本也無色或近于無色者判為陰性，顯色清晰者為陽性。但在 ELSIA中，正常人血清反應(yīng)后常可出現(xiàn)呈色的本底，此本底的深淺因試劑的組成和實(shí)驗(yàn)的條件不同而異，因此實(shí)驗(yàn)中必須加測陰性對照。陰性對照的組成應(yīng)為不含受檢物的正常血清或類似物。在用肉眼判斷結(jié)果時，宜用顯色深于陰性對照作為標(biāo)本陽性的指標(biāo)。目視法簡捷明了，但頗具主觀性。在條件許可下，應(yīng)該用比色計(jì)測定吸光值，這樣可以得到客觀的數(shù)據(jù)。先讀出標(biāo)本（sample，S）、陽性對照（P）、和陰性對照（N）的吸光值，然后進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算方法有多種，大致可分為陽性判定值法和標(biāo)本與陰性對照比值法兩類。
a. 陽性判定值
陽性判定值（cut-off value）一般為陰性對照A值加上一個特定的常數(shù)，以此作為判斷結(jié)果陽性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)。
用此法判斷結(jié)果要求實(shí)驗(yàn)條件十分恒定，試劑的制備必須標(biāo)準(zhǔn)化，陽性和陰性的對照品應(yīng)符合一定的規(guī)格，須配用的儀器，并嚴(yán)格按規(guī)定操作。陽性判定值公式中的常數(shù)是在這特定的系統(tǒng)中通過對大量標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)檢測而得到的?，F(xiàn)舉某種檢測 HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照品為不含HBsAg的復(fù)鈣人血漿，陽性對照品HBsAg的含量標(biāo)明為P=9±2ng /ml。每次試驗(yàn)設(shè)2個陽性對照和3個陰性對照。測得A值后，先計(jì)算陰性對照A值的平均數(shù)（NC X ）和陽性對照A值的平均數(shù)（PCX），兩個平均數(shù)的差（P-N）必須大于一個特定的數(shù)值（例0.400），試驗(yàn)才有效。3個陰性對照A值均應(yīng)≥0.5×NCX，并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而已另兩個陰性對照重新計(jì)算NCX；如有兩個陰性對照A值超出以上范圍，則該次實(shí)驗(yàn)無效。陽性判定值按下式計(jì)算：
陽性判定值=NCX+0.05
標(biāo)本 A值＞陽性判定值的為陽性，小于陽性判定值的為陰性。應(yīng)注意的是，式中0.05為該試劑盒的常數(shù)，只適合于該特定條件下，而不是對各種試劑均可通用。
根據(jù)以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對照和陽性對照也起到試驗(yàn)的質(zhì)控作用，試劑變質(zhì)和操作不當(dāng)均會產(chǎn)生"試驗(yàn)無效"的后果。
b. 標(biāo)本/陰性對照比值
在實(shí)驗(yàn)條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標(biāo)本（ S）和陰性對照（N）的A值后，計(jì)算S/N值。也有寫作P/N的，這里的P不代表陽性(positive)，而是病人（patient）的縮寫，不應(yīng)誤解。為避免混淆，宜用S/N表示。在早期的間接法ELISA中，有些作者定出S/N為陽性標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)多為各種測定所沿用。實(shí)際上每一測定系統(tǒng)應(yīng)該用實(shí)驗(yàn)求出各自的S/N的閾值。應(yīng)注意的是，N所代表的陰性對照是不含受檢物質(zhì)的人血清。有的試劑盒中所設(shè)陰性對照為不含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量較底的緩沖液，以致反應(yīng)后產(chǎn)生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因此，這類試劑盒規(guī)，如N<0.05（或其他數(shù)值），則按0.05計(jì)算，否則將出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
2、 競爭法
在競爭法 ELISA中，陰性孔呈色深于陽性孔。陰性呈色的強(qiáng)度取決于反應(yīng)中酶結(jié)合物的濃度和加入競爭抑制物的量，一般調(diào)節(jié)陰性對照的吸光度在1.0-1.5之間，此時反應(yīng)為敏感。
競爭法 ELISA不易用自視判斷結(jié)果，因肉眼很難辨別弱陽性反應(yīng)與陰性對照的顯色差異，一般均用比色計(jì)測定，讀出S、P和N的吸光值。計(jì)算方法主要也有兩種，即陽性判定值法和抑制率法。
a. 陽性判定值法
與間接法和夾心法中的陽性判定值法基本相同，但在計(jì)算公式中引入陽性對照 A值，現(xiàn)舉某種檢測抗HBc的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照為不含抗HBc的復(fù)鈣人血漿，陽性對照中抗HBc含量為125±1 00u/ml。每次試驗(yàn)設(shè)2個陽性對照和3個陰性對照。測得A值后，先計(jì)算陰性對照A值的平均值（NC X ）和陽性對照A值的平均數(shù)（PCX），兩個平均數(shù)的差（N-P）必須大于一個特定的數(shù)值（例如0.300）,試驗(yàn)才有效。3個陰性對照A值均應(yīng)小于2.000，而且應(yīng)≥0.5×NCX并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而以另2個陰性對照重新計(jì)算×NCX；如有2個陰性對照A超出以上范圍，則該次實(shí)驗(yàn)無效。陽性判定值按下式計(jì)算：
陽性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX
標(biāo)本A值≤陽性判定值的反應(yīng)為陽性，A＞陽性判定值的反應(yīng)為陰性。
b. 抑制率法
抑制率表示標(biāo)本在競爭結(jié)合中標(biāo)本對陰性反應(yīng)顯色的抑制程度，按下式計(jì)算：
抑制率（%）= （陰性對照A值-標(biāo)本A值）×/陰性對照A值
一般規(guī)定抑制率≥50%為陽性，＜50%為陰性。
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